ДОКУМЕНТЫ

ПАРТНЕРЫ

Влияние аллотрансплантатов черной субстанции на развитие аудиогенных судорог у крыс линии Wag/Rij со смешанной формой эпилепсии

Бирюкова ПМ Ветеринарная клиника "Центр"

Работа выполнена на базе Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, где уже более 5 лет поддерживается популяция крыс линии WAG/Rij, выведенной как инбрсдная линия крыс с генетической absence-эпилепсией [6]. Показано, что у некоторых крыс этой линии зарегистрировано Два типа эпилептической активности: аудиогенные судороги (АС) и пик-волновых разряды, характерные для absence-эпилепсии, в электрокортикограмме [4]. Такой смешанный тип эпилепсии - одна из наиболее трудных клинических проблем для фармакотерапии.

В течение последнего десятилетия для восстановления утраченных функций, коррекции медиаторной или нейрохимической патологии мозга активно применяется нейротрансплантация. Однако исследование возможностей коррекции судорожных состояний таким путем находится на раннем этапе. Данная работа является одной из серии исследований, направленных на поиск наиболее адекватных условий и схем нейротрансплантации для подавления генетически обусловленных судорог.

Ранее было показано, что трансплантация в кору "тормозных" структур - стриатума и мозжечка, приводящая к снижению, а в некоторых случаях к исчезновению АС у крыс линии Wistar, вызывала усиление АС у крыс линии WAG/Rij [1;2;7]. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что конвульсивная и неконвульсивная формы эпилепсии имеют в основе нарушения различных медиаторных систем [II]. Некоторые экспериментальные данные [5; 10] позволяют предположить, что в мозге крыс WAG/Rij существует дефект дофаминовой системы.

Учитывая все вышесказанное, мы решили применить метод аллотрансплантации для устранения или ослабления судорожной активности у крыс линии Wag/Rij, используя в качестве донорской дофаминсодержащую ткань. При этом сопоставлялись трансплантаты, локализованные в неокортексе и в стриатуме.

В своей работе мы преследовали цели:

1. Определить влияние аллотрансплантации дофаминергической ткани на интенсивность проявления аудиогенного припадка.
2. Сопоставить влияние трансплантатов, локализованных в неокортексе и в хвостатом ядре стриатума.
3. Определить влияние аллотрансплантации дофаминергической ткани в стриатум на характеристики разрядов пик-волна absence-эпилепсии.

Крыс массой 200-250 готбирали из общей популяции крыс линии WAG/Rij по стабильному наличию у них аудиогенных судорог. Исследовали 3 группы животных. Донорск}тожань объемом 0,1 -0,3 мм3 из области черной субстанции от 2-хдневныхноворождснных крысят пересаживали билатерально либо в сенсо-моторную кору (I группа - 13 крыс), либо в стриатум (II группа - 7 крыс) крыс линии Wag/Rij со смешанной формой эпилепсии. Контролем служили ложнооперированные (без трансплантата) животные (III группа - 10 крыс), которым вводили около 20 мкл физиологического раствора. Операции проводили в стереотаксическом приборе, под нембуталовым наркозом (30-40 мг/кг), в асептических условиях.

До операции у животных определяли стабильность аудиогенных реакций путем повторного трехкратного тестирования звуком с интервалом в 1 и 3 нед. Через 1,3,7,10,16 и 20 недель после операции крыс тестировали на наличие у них аудиогенных судорог. Эксперимент проводился в камере, где животному предъявлялся сложный звуковой сигнал измеренной частоты, в котором хорошо выражена ультразвуковая часть спектра (звон ключей). Этот раздражитель ранее уже использовался для вызова аудиогенных судорожных припадков [З]. Длительность используемого звукового раздражения была 1,5 мин. Сила возникшего аудиогенного припадка определялась по следующей шкале: 0 - отсутствие реакции; 1 балл - сильное моторное возбуждение, безудержный бег, прыжки; 2 балла - клонические судороги в позе "на животе", развивающиеся вслед за моторным возбуждением; 3 балла - продолжение клонических судорог, крыса переворачивается на бок; 4 балла - три предыдущие фазы заканчиваются тоническими судорогами. Произведено сравнение результатов звукового тестирования в различных экспериментальных группах по критерию Манна-Уитни.

После окончания тестирования АС (через 6-8 месяцев после трансплантации) проведено электрофизиологическое обследование у 4-х крыс II группы. К моменту регистрации у двух из этих крыс наблюдалось снижение сила АС, у двух - исчезновение АС. Нихромовые электроды диаметром 150 мкр в лаковой изоляции были вживлены под нембуталовым наркозом эпидурально в теменные области билатерально и в затылочную - справа. Индифферентный электрод распорлагался над мозжечком. Запись электрокортикограммы проводили на энцефалографе Bioscript BST-2000 с фильтрами высокой частоты 200 Гц и постоянной времени 0,3 с. Во время эксперимента крыса находилась в ящике 20х20х30 см и подсоединялась ко входу усилителя с помощью гибкого кабеля.

Через 6,5-9 месяцев после трансплантации проведен морфологический анализ мозга десяти крыс I группы (трансплантация в кору) и пяти крыс II группы (трансплантация в стриатум). Фронтальные серийные срезы мозга толщиною 20 мкм изготавливали на замораживающем микротоме и окрашивали по методу Ниссля. Визуальная идентификация трансплантатов проводилась по наличию глиальной границы с мозгом реципиента, нарушению стратификации и по различию размера и формы клеток трансплантата и прилежащих участков мозга реципиента; использовали световой микроскоп Axioplan-2 (Zeiss).

При морфологическом анализе мозга крыс I группы во всех случаях найдены жизнеспособные трансплантаты. Во II группе трансплантаты в нормальном состоянии обнаружены у трех из четырех обследованных крыс, в одном случае трансплантатат подвергся некрозу. Следы от введения иглы отмечены у всех обследованных животных.

Подавляющее влияние трансплантатов на силу АС наблюдалось и в I, и во II группе на всех этапах тестирования. Ни у одной ложнооперированной крысы снижение АС не было отмечено, напротив, наблюдалось усиление АС. Статистический анализ показал, что существуют достоверные различия между III группой и I через 16 и 20 недель после операции (р<0,05) и между III и II -через 7 и 20 недель (р<0,05). Обе группы с трансплантатом достоверно превосходят контрольную группу по количеству крыс без АС за период тестирования в целом. Достоверных различий между I и II группами не обнаружено.

У четырех крыс, подвергнутых электрофизиологическому обследованию, в электрокортикограммс зарегистрированы спонтанные генерализованные разряды пик-волна, при этом отмечена тенденция к усилению пик-волновой активности. У трех крыс выявлено значительное увеличение процента времени, занятого пик-волновыми разрядами (до 25-51%) и/или средней длительности одного разряда (до 29 с). Только у одной крысы (продемонстрировавшей снижение силы аудиогенного припадка) отмечались характерные для крыс линии WAG/Rij параметры разрядов пик-волна (определены на основании анализа записи ЭКоГ 72 крыс линии WAG/Rij).

1. У крыс линии WAG/Rij со смешанной формой эпилепсии аллотрансплантаты черной субстанции приводят к снижению или исчезновению аудиогенных судорог при трансплантации как в неокортекс, так и в стриатум.

2. При трансплантации ткани черной субстанции в стриатум эффект наступает раньше и более выражен в первые недели, чем при трансплантации в неокортекс. В последнем случае эффект нейротрансплантации наиболее выражен в поздние сроки (через 16-20 недель) после операции, мало отличаясь от таковых при трансплантации в стриатум в те же сроки. Необходимо большее количество данных для статистической оценки этих результатов.

У крыс линии WAG/Rij после трансплантации ткани черной субстанции в стриатум в ЭКоГ нс было отмечено уменьшения спонтанной пик-волновой активности. Напротив, было отмечено усиление пик-волновой активности absence-эпилепсии как в случае стойкого исчезновения аудиогенной судорожной активности, так и у животных, у которых произошло только снижение интенсивности АС. Таким образом, в отличие от АС не удалось достигнуть уменьшения неконвульсивной эпилептической активности подсадкой дофаминергической ткани. Эти данные позволяют предположить сложную взаимосвязь между двумя типами эпилепсии.

1. Ермакова И.В. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 126,1998 - С. 82
2. Ермакова И.В., Кузнецова ГД, Лосева Е.В., Петрова Е.В., Иоффе М.Е. // Журн. высш. нервн. деят., 46,4,1996 - С.776
3. Крушинский Л.В. Формирование поведения животных в норме и патологии М.: Изд-во МГУ, I960 - С.264
4. Кузнецова ГД // Журн. высш. нервн. деят., 48,1998 - С. 143
5. Мидзяновская И.С. // Журн. высш. нервн. деят., 48,1998 - С. 1111
6. Coenen A.M.L, van Luijtelaar E.LJ.M. // Epilepsy Res.,1,1987 - P.297
7. Ermakova I.V., Kuznetsova G.D., Loseva E.V., loffe М.Е., Petrova E.V. // Epilepsia 37,Suppl.4,1996-P.17
8. Ermakoy" I.V., Kuznetsova G.D., Loseva E.V., loffe М.Е. // Epilepsia, 38, Suppi 3 1997-P. I'M '
9. Ermakova I.V., Loseva E.V, Valouskova V., BuresJ. // Physiol. Behav., 45,1989 - P 235
10. Kuznetsova G.D., Petrova E.V, Coenen A.M.L, van Luijtelaar E.LJ.M. // Physiol Behav., 60,1996-P.I 165
11. 1l. Jobe P.C., Mishra P.K., Ludvig N., DaileyJ.W. In: Schwartzkroin PA, eds. Epilepsy: Models, Mechanisms and Concepts. Cambridge: University press, 1993 - P.94

ПРЕПАРАТЫ

ПАРТНЕРЫ